Que tal um bife de fungo?

      Além da produção de enzimas, antibióticos, ácidos orgânicos e uma infinidade de biomoléculas, os microrganismos ainda podem ser utilizados como alimento para pessoas e animais, sendo uma promissora fonte de proteína para tempos futuros. Os microrganismos podem ser leveduras, fungos ou algas. Anteriormente conhecido como " proteína microbiana", as proteínas originárias de microrganismos foram denominadas de Single Cell Protein (SCP)  pelo Prof. Scrimshow do MIT em 1967, por achar que a denominação anterior não contribuía para sua aceitação como alimento.

1- A biomassa microbiana como fonte de proteína: O processo SCP 

     Denomina-se proteina célula única (SCP) " ou " biomassa microbiana " o produto composto de células secas de microrganismos que foram cultivadas em larga escala para comercialização como suplementos na alimentação humana e animal. Embora não tenham uma aparência tão boa quanto um bife assado, são uma fonte de alto teor de proteína, podendo conter aminoácidos essenciais tais como lisina, metionina e cisteína . Além disso, é rica em vitaminas e pobre em gordura .

      

     Geralmente, não se trata de proteínas oriundas de um único microrganismo,  mas de células tratadas de diferentes formas a partir de uma variedade de microrganismos , mono e multicelulares , bactérias , leveduras, fungos ou algas (Tabela 10.1).

        Alguns dos microrganismos comumente utilizados na produção de SCP são: 

Fungos Filamentosos: Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Rhizopus cyclopium. São de fácil crescimento e colheita. Porém, apresentam taxas de crescimento mais baixas e menores teores de proteínas.

Leveduras: Saccharomyces cerevisae,  Candida tropicalis,  Candida utilis. Apresentam maior tamanho, menor teor de ácido nucleico e melhor aceitabilidade. Porém são de pobre digestibilidade, baixo teor de proteínas e taxa de crescimento lenta.

Algas:  Spirulina sp., Chlorella pyrenoidosa,  Chondrus crispus. Apresentam fácil crescimento e colheita. Tem proteína de boa qualidade. Porém apresentam parede celulósica de difícil digestibilidade e podem concentrar metais pesados.  

Bactérias:  Pseudomonas fluroescens,  Lactobacillus, Bacillus megaterium. Apresentam elevado teor de proteínas e parede celular digerível. Por outro lado, têm alto teor de DNA, pequeno tamanho e baixa densidade.

   A ideia de produzir proteína microbiana surgiu na Alemanha durante a Segunda Guerra Mundial, período no qual o mundo passava por escassez de alimentos e outros recursos por causa da guerra.   Os alemães produziram em certa escala leveduras e fungo (Geotrichum candidum) para fornecerem proteínas aos soldados (Figura 1 e 2). Com o fim da guerra, outras nações passaram a investir na idéia, como os ingleses, que criaram na Jamaica uma divisão para produção de leveduras. Atualmente, existem plantas em funcionamento para a produção de leveduras na Alemanha, Finlandia, Africa do Sul, Jamaica, India, Formosa e EUA. Tal produção representa uma alternativa para as localidades onde há fontes de carbono baratas, mas com escassez de proteínas e vitaminas.

Figura 1 - Geotrichum candidum em queijo

Figura 2 - Aspectro do Geotrichum candidum ao microscópio

      

       Em 1950, a British Petroleum iniciou uma produção de SCP comercial. A primeira SCP utilizada comercialmente como aditivo para alimentação animal foi o  Pruteen, produto elaborado a partir de bactérias Methylophilus methylotrophus cultivadas em metanol, o qual  continha um teor de proteína de 72% (Figura 4).

Figura 4 - Fluxograma de produção do Pruteen. A direita, biorretor moderno para sua produção

     Em tempos passados, nos EUA eram aproveitadas as leveduras das cervejarias e fabricas de licores para fins alimentícios e medicinais (Saccharomyces cerevisiae, carlsbergensis e elipsoideus). Eram chamadas de leveduras secundárias ( quando o cultivo é específico para estas finalidades, são chamadas de leveduras primárias). Leveduras obtidas de cervejarias têm sabor amargo. Um tratamento consiste na lavagem com NaOH e água, seguida da  adição de  ácido fosfórico (até pH 5,5) e sal, com posterior secagem em secador de tambor. Pode-se adicionar tiamina, riboflavina e niacina. Já as leveduras primárias podem ser obtidas por cultivo de algumas gerações, em meio de melado ou outro similar. Em ambos os casos, as células devem estar mortas, pois o consumo de “tortas de levedura” contendo células viáveis leva a perda de vitaminas.

Figura 4c. Proteína SCP

2- Caracteristicas da SCP

    A SCP  apresenta vantagens em relação a produção de soja. A principal é que sua produção é virtualmente imediata e requer um baixo nível de tecnologia. Normalmente ela ocorre em fermentadores, onde é induzido o crescimento de células microbianas, que são alimentadas com resíduos agrícolas e industrial (Figura 5). A biomassa é então recolhida e adequadamente tratada por processos de secagem antes da comercialização.

Figura 5 - Produção de SCP a partir de resíduos agroindustriais

    Para a utilização por  seres humanos, é necessário um tratamento para remover certos compostos que apresentam riscos nutricionais, tais como o elevado teor de ácidos nucleicos, para garantir a segurança e a qualidade do produto. Proteínas microbianas são semelhantes as da  farinha de peixe, soja ou soro de leite. As suas aplicações alimentares não são limitados ao consumo direto, mas também pode ser usado para o desenvolvimento de outros produtos, tais como lípidos, proteínas, ácidos nucleicos (DNA e RNA), hidratos de carbono e vitaminas.

    Atualmente, a SCP é testada como uma solução para determinados problemas de saúde; em especial, o controle imunológico; como nutrientes em doentes com anemia, hiperglicemia e hipercolesterolemia.Além disso, algumas pesquisas mostraram se possível sua aplicação no tratamento de doenças oculares, tais como retinite pigmentosa, sendo um exemplo da grande variedade de biotecnologia para o progresso, sustentabilidade e bem-estar .

    Nos países desenvolvidos, os altos padrões de vida têm levado a uma crescente demanda por compostos para alimentação animal, proteína de alta qualidade, que são fundamentais para as técnicas modernas para a produção de ovos, aves, gado de corte e suínos. Estes compostos de alimentação preparados para satisfazer os requisitos nutricionais dos animais total de proteína contêm entre 10 e 30% por unidade de peso. Isto é tipicamente fornecida pela adição de farinhas de sementes oleaginosas, tais como soja, ou farinha de peixe e SCP poderia ser uma alternativa válida para algumas destas fontes tradicionais.

Figura 6 - A obtenção de proteína animal não é sustentável e acarreta problemas ambientais. A SCP pode substituir a proteína animal ou proteínas utilizadas na alimentação de rebanhos com muitas vantagens.

    Dentre as vantagens que a SCP oferece está a redução do fluxo de soja, farinha de peixe e cereais para a alimentação animal, o uso de SCP poderia tornar esses produtos mais acessíveis para o consumo humano. 

   Tal processo facilitaria a produção de proteínas na Europa, Japão e outras áreas nas quais  não poderiam ser cultivadas culturas de soja. Nesse caso, a produção em larga escala de SCP tornaria a produção animal nestas áreas menos dependente de proteínas importadas.

   Quando comparado com os métodos tradicionais de produção de proteínas para a alimentação humana ou animal produção em escala industrial de biomassa microbiana para o mesmo uso tem algumas Vantagens: 

• Os microrganismos geralmente têm uma alta taxa de multiplicação e Facilidade de modificação genética
• São ricos em proteínas ( em termos de peso seco de biomassa podem conter proteína microbiana 30-80 % ), 
• Pode-se utilizar um grande número de diferentes fontes de carbono ( algumas das quais são tradicionalmente considerados resíduos ),
• Os microrganismos podem ser selecionados de forma relativamente fácil, 
• As instalações de produção ocupam áreas limitadas e apresentam elevados rendimentos 
• A produção microbiana é independente das variações climáticas e sazonais e são, portanto, mais fácil de planejar .

Como nem tudo são vantagens, algumas desvantagens podem ser apontadas: 

• Alto teor de ácidos nucleicos que conduzem a níveis elevados de ácido úrico. 
• Desenvolvimento de pedra nos rins e gota se consumido em alta qualidade. 
• Possibilidade de a presença de metabólitos tóxicos secundários .
• Pobre digestibilidade 
• Diarreia provocada pelo consumo de proteínas estranhas
• Reações cutâneas de hipersensibilidade.

3. O processo SCP

     As etapas do processo são as seguintes:

1. Fornecimento de uma fonte de carbono: A fonte de carbono deve ser, de preferência, abundante e de baixo custo. Podem ser derivados de petróleo, como o metanol, ou biomassa como algas e resíduos agroindustriais. Estes últimos são preferidos, pois trata-se geralmente de rejeitos da agroindústria, ricos em fontes de carbono e nutrientes, tais como: restos de frutas, verduras, culturas vegetais, industria de laticínios, etc.

2. Preparação do meio de cultivo: Além da fonte de carbono, deve-se fornecer ao meio de cultivo os nutrientes essenciais para o crescimento do microrganismo, tais como fontes de nitrogênio, fósforo e outros essenciais para o microrganismo em questão. 

3. Esterilação do meio de cultivo. A esterilização irá garantir que qualquer outro microrganismo que esteja presente no meio de cultivo ou nas instalações  seja eliminado para não contaminar a SCP produzida com microrganismos indesejáveis.

4. O cultivo dos microrganismos desejados. O microrganismo escolhido é inoculado no meio de cultivo estéril e se reproduz até estabilizar o crescimento. 

5. A separação da biomasa microbiana do meio esgotado. A biomassa produzida é separada do meio de cultivo por filtração ou centrifugação.

6. O tratamento subsequente de biomassa com ou sem operações de purificação específicas. Um dois tratamentos é a desativação e secagem dos microrganismos.

A Figura 8 mostra um esquema para obtenção de proteína animal a partir de proteína microbiana

Figura 8 - Proteína microbiana como ração animal

  4- seleção de microrganismos 

    É um passo muito importante, pois a qualidade da proteína depende totalmente do micróbio que é usado para a produção. Assim, deve ser feita uma seleção cuidadosa da estirpe a ser utilizada. Alguns critérios a serem utilizados são: 

• Não devem ser patogênicos para plantas, animais ou seres humanos. 
• Deve ter bom valor nutritivo . 
• Deve ser aceito como alimento humano ou animal . 
• Ausência de compostos tóxicos. 

5- os custos de produção

   Os custos de produção são dependentes dos recursos utilizados e estão associados a:

• A taxa de crescimento do microsrganismo
• Produção. 
• O teor de proteína da célula microbiana
• Requisitos nutricionais da célula e suplementos utilizados
• As vantagens seletivas do meio utilizado . 
• Boas propriedades de separação e secagem. 

Referências (Livros): Biotechnology- Dubey,
                                   Basic Biotechnology- Colin & Ratledge,
                                   Molecular biotechnology- Channarayappa
                                   Biotechnology- Satyanarayana.

Adsorção em Leito expandido (ALE)

     1. Princípio de funcionamento

     Originária da cromatografia de proteínas, a técnica de adsorção em leito expandido baseia-se na fluidização controlada de um leito formado por adsorventes cromatográficos. Durante a operação, o leito é expandido, promovendo o aumento dos interstícios no leito, o que permite a aplicação direta de uma alimentação contendo material biológico em suspensão (ex: células, detritos, substratos insolúveis). Durante a operação, é aplicada uma força denominada de tensão cromatográfica média que promove a distribuição do adsorvente em distintas camadas, segundo o tamanho e densidade de suas partículas. Assim, são formados múltiplos estágios de adsorção das moléculas alvo sobre as partículas de adsorvente fluidizadas. 

     Esta propriedade em particular induz a formação de um leito classificado pela fluidização devido à redução da mobilidade local dos grãos de adsorvente utilizados na fluidização, um pré-requisito essencial para promover o aumento de espaços vazios entre as partículas sólidas. A Figura 1 mostra o esquema simplificado de uma coluna de adsorção para leito expandido.

Figura 1.  Esquema de uma coluna de leito expandido

Um leito expandido é obtido a partir de um leito sedimentado, através do aumento da vazão de fluido que escoa pelo leito até que seja atingida uma velocidade na qual a força de arraste seja igual ao peso das partículas, ou seja, a força de arraste seja igual à queda de pressão em uma determinada área transversal. Assim, forma-se um leito fluidizado estável no qual as partículas do adsorvente estão suspensas devido ao equilíbrio entre a velocidade de sedimentação e a velocidade de fluido ascendente, por isso denominado de leito expandido. 

O vídeo a seguir ilustra a formação de um leito expandido:

Vídeo1 - Expansão do leito

Esta técnica difere-se da fluidização convencional, a qual caracteriza-se pela ocorrência de mistura, o que resultaria em uma baixa eficiência da ligação adsorvente proteína caso fosse utilizada para recuperar proteínas. Portanto, a técnica de leito expandido opera em condições suaves de fluidização do leito, ocasionada pela segregação das partículas adsorventes, caracterizada pelo valor de Rep (número de Reynolds de partícula) baixo, da ordem de 0,5-1, que promove o aumento da eficiência da ligação adsorvente-partícula.

Em termos operacionais, a sequência de eventos no processo de purificação utilizando leito expandido é similar a de um leito fixo. O estágio inicial consiste no contato entre o adsorvente e o adsorbato, ou seja, a biomolécula-alvo. No caso de um leito expandido, é importante determinar as características de expansão do leito, verificando-se como a altura do leito varia em relação a vazão do líquido de entrada e como a presença de partículas afeta a expansão do leito. 

Também é importante verificar o quanto o processo de adsorção no leito expandido difere daquele que ocorre em leito fixo, aspecto que pode ser convenientemente abordado determinando-se a curva de ruptura. Por fim, é necessário verificar o quanto o processo de adsorção é afetado pela presença de células. Na Figura 2 é ilustrado o princípio básico de adsorção em leito expandido.

Figura 2.7. Apresentação esquemática da Adsorção em Leito Expandido (Amersham Pharmacia Biotech, 1997)

Inicialmente, o leito contendo o adsorvente sedimentado é expandido e estabilizado através da injeção de tampão para a coluna. O pistão da coluna é posicionado na parte superior durante esta fase. Após a estabilização do leito, a coluna é alimentada com o extrato enzimático bruto com a mesma vazão do fluxo ascendente utilizado na expansão e estabilização do leito. Nessa etapa, as proteínas-alvo são vinculados ao adsorvente, enquanto as impurezas (restos celulares, células, partículas e contaminantes passar sem impedimentos, sendo arrastados para fora da coluna fluxo de líquido ascendente. 

Em seguida, uma solução de lavagem é aplicada na coluna, para a remoção de material contaminante fracamente ligado, como células residuais, restos celulares e outros tipos de material particulado, que são lavados para fora do leito expandido utilizando fluxo ascendente. Quando todo o material fracamente retido é lavado para fora da coluna, o fluxo de líquido é interrompido e as partículas de adsorvente contendo a proteína-alvo acomodam-se rapidamente na coluna, sedimentando-se. 

O pistão da coluna é posicionado na superfície do leito sedimentado, e injeta-se um tampão adequado em fluxo descendente que promove a eluição das proteínas, que são capturadas a partir do leito sedimentado. 

O eluído contém agora a proteína-alvo em maior concentração, livre de partículas contaminantes e parcialmente purificada, pronto para posterior purificação por outra técnica, como a cromatografia. Após eluição, o leito é regenerado por lavagem com fluxo descendente que remove as proteínas mais fortemente ligadas, remanescentes da fase de eluição. 

A principal vantagem na utilização da adsorção em leito expandido sobre a cromatografia tradicional em leito fixo, é que a coluna pode ser alimentada com solução contendo células ou resíduos celulares em suspensão sem a necessidade de remoção prévia das mesmas, reduzindo o número de etapas no processo e evitando a perda de atividade da biomolécula alvo. Dependendo dos valores de alguns parâmetros do sistema tais como: tipo e concentração da biomassa, características do ligante, força iônica da fase fluida e pH; diferentes situações hidrodinâmicas podem ser observadas no decorrer do processo ideal em plug flow até a sorção limite, onde ocorre a fluidização agregativa e estagnação do meio.

 A operação de um leito expandido é diferente dos processos cromatográficos convencionais no que diz respeito a porosidade (ε) do leito expandido (0,7 a 0,8) que é maior que a  utilizada em processos de leito fixo, cujos valores típicos são de aproximadamente 0,4. O volume de fluido aplicado ao leito em equilíbrio, é geralmente cinco vezes o volume do leito com adsorvente empacotado.

 

2- Hidrodinâmica do leito expandido

O conhecimento à respeito do funcionamento do leito em função das propriedades básicas das partículas e do fluido é de fundamental importância para se promover operações em leito expandido. Uma forma de caracterização do leito consiste em obter medidas da expansão do leito em função da velocidade do fluido, ou observando-se a influência de outros fatores, tais como: distribuição de tamanho de partículas, viscosidade do fluido, presença de células e condutividade do caldo. O sucesso na purificação de proteínas por meio da técnica de adsorção em leito expandido depende da capacidade do sistema em produzir um leito com expansão estável, sendo tal condição essencial para a realização de um aumento de escala a partir dos resultados obtidos em escala de bancada.

Operando-se a baixas velocidades superficiais, o leito sedimentado comporta-se como um leito fixo com o fluxo passando pelos interstícios. Um aumento na velocidade de fluxo causa um relaxamento no leito sedimentado, até ser atingida a velocidade mínima de fluidização, a qual caracteriza a transição entre o estado sedimentado e o fluidizado. Com o crescente aumento da velocidade superficial, todas as partículas ficam em suspensão, sem estarem em contato permanente com as outras partículas. 

No ponto em que ocorre o relaxamento, ou seja, na velocidade mínima de fluidização, a pressão da coluna está em equilíbrio com a força de arraste das partículas do adsorvente: 

onde ΔP representa a variação de presão, ε a porosidade do leito, Ρ_p a densidade da partícula, Ρ_l é a densidade do líquido, g a gravidade, e h é a altura da coluna.

Como nos demais estudos de fluidodinâmica, em adsorção em leito expandido deve-se ter atenção especial com a sedimentação e a fluidização do material particulado, com o objetivo de se estabelecer as condições ideais de operação do leito expandido. 

Richardson & Zaki (1954) estudando o comportamento de diversos tipos de materiais em leito expandido, obtiveram uma equação que relaciona a velocidade do fluido (U) com a velocidade terminal da partícula (Ut) e a porosidade do meio (ε), descrita abaixo:

      O índice de expansão n, também conhecido como índice de Richardson-Zaki, é função do número de Reynolds terminal (Re_t), que é dado por:

      Onde d_p representa o diâmetro da partícula, ρ_l a densidade do líquido, μ a viscosidade do líquido e U_t a velocidade terminal ou de Stokes apresentada como:

                                                          

 Sendo ρ_p a densidade da partícula.

Portanto, o valor de n é dado em função do número de Reynolds terminal (Re_t) e da relação entre o diâmetro da partícula (d) e da coluna (D). As Equações a seguir exibem o valor de n para diversas faixas de valores de Re_t :

 Os parâmetros mais importantes para a fluidização das partículas são o diâmetro e a densidade da matriz, os quais controlam a velocidade terminal em um leito fluidizado. A massa específica da partícula (ρ_p) é a massa (m_p) por unidade de volume da mesma (V_p), enquanto que o volume do leito (V_l) pode ser obtido pela multiplicação da área da secção transversal da coluna (A_t) pela altura do leito (H). Dessa forma, a porosidade do leito (ε) pode ser dada por:

  

    

Assim, a Equação de Richardson-Zaki pode ser linearizada, permitindo a determinação experimental da velocidade terminal da partícula (U_t) e o coeficiente de Richardson-Zaki (n) a partir da porosidade do meio e a velocidade do fluido (U).

                                                      

   Embora a estabilidade do leito possa ser determinada a partir da visualização do comportamento do leito, a observação visual tem apenas caráter confirmativo, pois apesar de ser rápida e não dispendiosa, o uso desse método não garante a reprodutibilidade dos resultados.

 

Um modo mais prático de se caracterizar um leito expandido é através do grau de expansão, um número adimensional que relaciona a altura do leito após a expansão (H) com a altura do leito sedimentado (H₀) para uma determinada velocidade linear do fluido. Este é um método prático, muito utilizado na caracterização dos leitos expandidos: 

                                                     

 A distribuição do tempo de residência (DTR) é outro parâmetro que pode ser utilizado para avaliação de um leito expandido. É obtida a partir de uma técnica de estímulo e resposta que caracteriza o tipo de escoamento dentro da coluna. A determinação do tipo de escoamento existente, seja ele empistonado (plug flow) ou misturado (back mixing) é de suma importância, haja vista que as diferentes características do tipo de escoamento influenciam a cinética de adsorção proteína-adsorvente. 

Dentre as técnicas de estímulo e resposta existentes, as mais utilizadas são as técnicas conhecidas como pulso e frontal. São técnicas utilizadas na na indústria e são úteis para avaliação do comportamento do leito expandido, revelando os desvios de um reator tubular ideal. A distribuição do tempo de residência (DTR) é obtida usando-se um traçador e caracteriza o tipo de escoamento existente dentro da coluna. A determinação da DTR pode ser utilizada para avaliação do grau de dispersão axial e definição do número de pratos teóricos. 

Um procedimento comum na determinação da DTR consiste na injeção de uma solução diluída de acetona na coluna, que será utilizada como traçador. No fluxo efluente da coluna é feita a medida da absorção UV da acetona por meio de um detector ou espectrofotômetro. O número de pratos teóricos é calculado a partir do tempo de residência médio do traçador na coluna. A descrição do procedimento de teste teste e os cálculos utilizados para determinar o número de pratos teóricos é dada a seguir:

Durante o teste de vazão, marca-se a altura do leito expandido na coluna, enquanto injeta-se tampão; O pistão é posicionado próximo à superfície do leito expandido. A coluna é então alimentada com a solução contendo o traçador e aciona-se o cronômetro. Quando a leitura de absorbância é máxima (100%), o traçador atingiu a concentração máxima.  Marca-se então um tempo de referência nessa região do gráfico (tempo zero) e substitui-se o traçador pela solução tamponante. O sinal resposta começa a decair até atingir a linha de base (etapa referente ao sinal negativo), como pode ser verificado na Figura 2.8. O tempo (t) é definido como sendo a distância do tempo zero até a leitura de 50% da absorbância máxima. O desvio padrão (σ) é definido como a metade da distância entre os pontos de leitura 15,85% e 84,15% da absorbância máxima. O número de pratos teóricos (N) é determinado pela técnica do sinal negativo:

                  

 

Figura 3. Determinação do tempo de residência (DTR) Fonte: EBA HANDBOOK, AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH (1997).

A análise frontal com sinal negativo relaciona o coeficiente de dispersão axial (D_axi) e o número de pratos teóricos (N) pela relação:

 Onde: (U) a velocidade do fluido, (D_axi) o coeficiente de dispersão axial da fase líquida, (N) o número de pratos teóricos, (H) a altura do leito expandido e (ε ) a porosidade do leito.

3. Transporte de massa no fluido

Durante o processo de adsorção, a proteína deve ser transferida da solução para a superfície do adsorvente antes de se difundir para a superfície interna dos poros. Assim, é comum a expressão do coeficiente de transferência de massa (kf) em termos do número de Reynolds e do número de Schmidt, que baseia-se na existência de um filme de líquido estagnado sobre a superfície externa da partícula. Nos processos com leito fluidizado é importante considerar o efeito da expansão do leito que, por sua vez, é função da velocidade.

 Segue uma correlação para o cálculo de coeficiente de transferência de massa na fase líquida, considerando o efeito da expansão do leito:

  

O valor de k_f  pode ser influenciado pelos parâmetros de operação dos processos, tais como: vazão, viscosidade da fase líquida e dimensão das partículas.

 

4. Transporte de massa na partícula

Os adsorventes empregados na adsorção de proteínas são porosos, com sítios ativos localizados na superfície interna. A adsorção de proteínas em colunas cromatográficas é um processo cuja taxa de difusão para os poros dos adsorventes é um fator limitante. Dentre os parâmetros que influem no desempenho do leito do leito destacam-se a difusividade efetiva e o tamanho da partícula.