Precipitação de Proteínas

1- Recuperação de proteínas por precipitação

    As proteínas ou enzimas de interesse presentes no extrato fermentado bruto podem ser precipitadas pela adição de sal, solventes ou polímeros orgânicos ou pela variação do pH e temperatura da solução. Os agentes precipitantes mais comuns estão listados na Tabela 1.

Tabela 1: Agentes precipitantes

    A propriedade de um sal particular ser utilizado como agente precipitante é descrito pela chamada série de Hofmeister, mostrada abaixo na Figura 1.

Figura 1- Série de Hofmeister 

    A precipitação por sais é um dos métodos mais comum de precipitação de proteínas, utilizado tanto em escala de bancada quanto em escala industrial. A adição de sal em uma solução contendo proteínas promove a precipitação destas devido a uma redução na solubilidade decorrente de um efeito “salting-out” (hidrofóbico) ou da combinação de um efeito “salting-in” (eletrostático) com um efeito “salting-out”. O efeito “salting-in” faz com que a solubilidade do soluto aumente com o aumento da concentração do sal. Já o efeito “salting-out” provoca a redução da solubilidade com aumento da concentração do sal. 

    A redução da solubilidade das proteínas ocorre porque os íons do sal competem com a proteína pelas moléculas de água, diminuindo a solubilidade da proteína, uma vez que a camada de hidratação é parcialmente removida e as interações proteína-proteína se tornam relevantes, principalmente no que diz respeito à interações hidrofóbicas. Outra explicação pode ser dada em termos do aumento da tensão superficial do líquido devido à adição de sal, que aumenta a energia livre necessária para a formação de uma cavidade no solvente, na qual a molécula de proteína estaria dissolvida. 

    Dentre os sais utilizados para promover a precipitação de proteínas, o sulfato de amônio destaca-se por ser altamente solúvel, forma soluções de baixa densidade e seus íons possuem posição favorável na série de Hofmeister com relação à efetividade de precipitação. Além disso, o sal apresenta baixo custo, alta pureza, impede a proliferação de bactérias na solução e não apresenta efeitos desnaturantes. 

   Quando ocorre a precipitação de proteínas por sais, é formado um sistema bifásico constituído de uma fase líquida concentrada em eletrólito e uma fase composta contendo a proteína precipitada e uma grande quantidade de fase líquida salina, ou sal ligado intrinsecamente à proteína. Isto constitui uma desvantagem, pois são necessários tratamentos subseqüentes como diálise ou diafiltração para a eliminação do sal presente no precipitado e o processamento da fase líquida para sua reutilização ou descarte. Esses tratamentos limitam em parte as aplicações do processo de precipitação por “salting-out” devido ao custo dos mesmos. Outra técnica para promover a precipitação de proteínas é a adição de solventes orgânicos, como o etanol e a acetona.

    A adição de solventes orgânicos promove a precipitação de proteínas devido à diminuição da atividade da água na solução, pois a água é substituída pelo solvente orgânico. A adição do solvente provoca a diminuição da constante dielétrica da solução, intensificando as forças de atração entre as cargas opostas das moléculas de proteína, reduzindo o poder de solvatação destas moléculas pela água, uma vez que há o deslocamento e imobilização parcial das moléculas de água para a hidratação do solvente orgânico. 

   Nesse processo, as variáveis: concentração do solvente orgânico, concentração de proteína, pH, força iônica e temperatura são mantidas sob controle. É imprescindível que as operações de precipitação com solvente sejam feita á baixa temperatura, para evitar a desnaturação das proteínas. Como a adição de um solvente orgânico diminui o ponto de congelamento da solução, podem ser utilizadas temperaturas inferiores a 0 °C.

    A precipitação isoelétrica é uma técnica que explora o fato das proteínas apresentarem baixa solubilidade no seu ponto isoelétrico. Nesta técnica, ajusta-se o pH do meio até que este seja igual ao ponto isoelétrico (pI) da proteína. Neste pH, a carga líquida da molécula é nula, e a repulsão eletrostática entre as moléculas é mínima, prevalecendo as interações hidrofóbicas proteína-proteína. Em alguns casos, podem ocorrem desnaturação e inativação da proteína precipitada, o que torna esse processo útil na remoção de proteínas indesejáveis da solução que contém a proteína-alvo, desde que nas condições de precipitação a proteína alvo seja estável. 

     

      Além do pH, outro parâmetro que influencia a precipitação de proteínas em soluções de sais é a temperatura. Mantendo a concentração de sal constante e variando a temperatura é possível fracionar uma solução contendo proteínas. Após a precipitação por qualquer um dos métodos apresentados, as proteínas são geralmente recuperadas por centrifugação e utilizadas nas etapas seguintes de concentração e purificação.