Recuperação e purificação de enzimas

    O desenvolvimento de um processo de recuperação e purificação de enzimas depende inicialmente da localização da enzima de interesse, ou seja, se ela é intracelular ou extracelular. Para enzimas extracelulares, o processo de recuperação tem início no líquido fermentado ou, no caso de fermentação semissólida, no extrato fermentado bruto. 

No caso de enzimas intracelulares, o custo de produção é mais elevado, pois é necessária uma etapa inicial que promova a ruptura da célula do microrganismo e posterior liberação das enzimas produzidas. É importante que todas as etapas do processo de separação e recuperação de enzimas sejam conduzidas em condições não desnaturantes, ou seja, condições que não produzam desativações ou danos irreversíveis à estrutura enzimática. O custo de produção de enzimas está associado não só ao tipo de excreção celular, mas também depende do grau de pureza requerido no processo.

1- Recuperação das enzimas obtidas por fermentação semissólida

Uma etapa inicial da recuperação de enzimas obtidas por fermentação semissólida é a lixiviação do material fermentado. A lixiviação consiste na dissolução preferencial de um ou mais solutos de interesse por meio do contato entre um meio sólido e um solvente líquido. 

Como solvente, podem ser utilizados: água, tampões, soluções salinas diluídas ou soluções aquosas de glicerol. Após uma operação de separação do tipo sólido-líquido, obtém-se um extrato enzimático límpido. Alternativamente, a massa semissólida pode ser seca a baixas temperaturas, antes da extração. O material seco pode ser armazenado para posterior manipulação ou pode ser usado como uma preparação comercial bruta. O extrato bruto líquido pode ser concentrado a vácuo ou por ultrafiltração. O concentrado assim obtido pode ser vendido na forma líquida, após a adição de estabilizantes, como, por exemplo, glicerol ou tampões.  

Para desenvolver um processo de lixiviação com sucesso, além da seleção do equipamento adequado, existe a influência de diferentes variáveis, entre as quais se destacam a preparação dos sólidos, a relação sólido/solvente, a temperatura do processo, o pH do solvente, a tensão superficial do líquido, o grau de agitação do sistema, e a presença ou não de reação química na extração.

A relação entre a quantidade de sólido a tratar e o volume de solvente é de grande importância. A intensidade e o caráter do processo de extração sólido-líquido dependem em grande parte da difusividade do soluto na fração do solvente selecionado, assim como da concentração de saturação do soluto no solvente, pois está diretamente relacionado com a força motriz do processo. Por outro lado, é necessário levar em consideração que um grande volume de solvente na extração dos solutos aumenta consideravelmente os custos de purificação e recuperação do produto de interesse. 

Já a agitação, favorece a difusão dos solutos no solvente. Além disso, a extração de enzimas e proteínas deve ser realizada em valores de temperatura e pH onde a estabilidade seja ótima e, sua atividade biológica seja igualmente elevada, sem causar danos às biomoléculas ou ao solvente.

Uma vez obtido o extrato enzimático, pode-se seguir outras operações unitárias com o objetivo de recuperar, concentrar e purificar as biomoléculas de interesse.

2. Problemática da extração e purificação de bioprodutos

É comum em diversos processos industriais é a necessidade de separar os constituintes de uma mistura líquida homogênea composta de dois ou mais componentes. Muitas vezes, ou métodos existentes para realizar esta separação possuem aplicação limitada pelas características físico - químicas dos componentes da mistura a ser separada, pelos custos do processo de separação e pelas condições disponíveis para a implantação do processo escolhido.

A extração e o isolamento de proteínas após fermentação em larga escala ou provenientes de uma suspensão de células já eram problemas críticos da biotecnologia em meados do século XX. Geralmente, a separação e purificação de enzimas do meio de cultivo constituem a maior parte do custo total de sua produção. Por esta razão, existe a necessidade de se desenvolver técnicas em grande escala que sejam eficientes, eficazes, econômicas e alcancem altos graus de recuperação e pureza, mantendo a atividade biológica da enzima.

Além disso, grande parte dos esquemas utilizados para a purificação de proteínas envolve diversas operações unitárias no processo de Recuperação e Purificação de Bioprodutos (RPB), o pode resultar em baixo rendimentos e elevação de custos. A busca de solução para este problema tem incentivado o desenvolvimento de técnicas que simplifiquem e diminuam o número de operações utilizadas na purificação de biomoléculas, já que nesses processos, operações convencionais como a extração líquido-líquido utilizando solventes não é adequada pelo fato da maioria dos solventes utilizados serem tóxicos e provocarem a desnaturação de proteínas. 

Por causa das características dos sistemas biotecnológicos, a etapa de purificação torna-se a parte mais onerosa do processo de produção de biomoléculas. Mais de 50% do custo total dos processos nas indústrias biotecnológicas estão relacionados aos processos de purificação, os quais podem representar até 80% do custo total.  

As etapas de purificação de bioprodutos são tão ou mais desafiadoras que o estudo e o desenvolvimento da etapa de cultivo, uma vez que não existem processos de purificação geral.

3. Critérios para operação de extração líquido-líquido em bioprocessos

Para aplicações em bioprocessos, um meio de extração necessita atender certos critérios, já que parâmetros como a solubilidade e a estabilidade dos compostos são importantes e não devem ser desprezados. Eis alguns critérios:

- O meio não deve ser tóxico ao sistema biológico nem ao homem;

- A recuperação do bioproduto a partir do meio extrator deve ser fácil;

- Deve ter baixo custo e estar disponível comercialmente em grande quantidade;

-  Deve ser esterilizável;

- Ser imiscível ou parcialmente miscível com soluções aquosas;

- Não deve apresentar tendências de formação de emulsões estáveis com materiais biológicos;

- Não ser inflamável.

Além disso, para processos de extração do tipo líquido-líquido, o sistema deve formar duas fases imiscíveis ou parcialmente miscíveis com densidades diferentes, para possibilitar a recuperação do bioproduto desejado, concentrado em uma das fases.